細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置
時(shí)間：2021/8/12 14:54:20
組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺(tái)的廣泛使用，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺(tái)的廣泛使用，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲(chǔ)藏。
1．無菌操作區(qū)
（1）無菌操作室：無菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。 理想的無菌操作室應(yīng)劃為三部分：
a) 更衣室—―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。
b) 緩沖間—―位于更衣間與操作間之間，目的是為了保證操作間的無菌環(huán)境，同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。
c) 無菌操作間—―專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過高（不超過2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑無死角以便清潔和消毒。工作臺(tái)安置不應(yīng)靠墻壁，臺(tái)面要光滑壓塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。
無菌操作間的空氣消毒：
紫外線燈—－產(chǎn)生臭氧，并且室內(nèi)溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康。 空氣過濾的恒溫恒濕裝置—－最 好。
表1 潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度級(jí)別表
潔凈度級(jí)別 塵粒最大允許數(shù)／立方米 微生物最大允許數(shù) 浮游菌／立方米 沉降菌／皿
100級(jí) 3,500 0 5 1
10000級(jí) 350,000 2,000 100 3
100000級(jí) 3,500,000 20,000 500 10
300000級(jí) 10,350,000 60,000 - 15
無臭氧紫外線消毒器
電子消毒滅菌器—－在高壓電場(chǎng)作用下，電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強(qiáng)烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，能同細(xì)菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進(jìn)行氧化分解反應(yīng)，從而靠臭氧氣體彌漫性擴(kuò)散達(dá)到殺菌之目的，消毒時(shí)沒有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30～40min即能自行還原成氧氣，空氣不留異味，消毒物體表面不留殘毒。
（2）凈化工作臺(tái)：操作簡(jiǎn)單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺(tái)主要有兩種：a)側(cè)流式或稱垂直式 b)外流式或稱水平層流式。
凈化工作臺(tái)工作原理（大致相同）—－通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。
外流式（水平式）工作臺(tái)—－凈化后的空氣面向操作者流動(dòng)，因而外方氣流不致混入操作，但進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作則對(duì)操作者不利。工作臺(tái)結(jié)構(gòu)為開放式（已少用）。
凈化工作臺(tái)應(yīng)用注意：
（1）凈化工作臺(tái)應(yīng)安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內(nèi)，以免塵土過多易使過濾器阻塞，降低凈化效果，縮短其使用壽命。
（2）新安裝的或長(zhǎng)期未使用的工作臺(tái)，工作前必須對(duì)工作臺(tái)和周圍環(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進(jìn)行滅菌處理。
（3）使用凈化工作臺(tái)前，應(yīng)先用75％酒精擦洗臺(tái)面，并提前以紫外線滅菌燈照射30～50min處理凈化工作區(qū)內(nèi)積存的微生物。關(guān)閉滅菌燈后應(yīng)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。
（4）凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流流型不受干擾。
（5）注意凈化區(qū)內(nèi)氣流的變化，一旦感到氣流變?nèi)?，如酒精燈火焰不?dòng)，加大電機(jī)電壓仍未見情況改變則說明濾器已被阻塞，應(yīng)及時(shí)更換。一般情況下，高效過濾器三年更換一次。更換高過濾器應(yīng)請(qǐng)專業(yè)人員操作，以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布（無紡布）應(yīng)定期清洗更換，時(shí)間應(yīng)根據(jù)工作環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔3-6個(gè)月進(jìn)行一次。
（6）凈化工作臺(tái)使用完畢應(yīng)及時(shí)清理工作臺(tái)面上的物品并用酒精擦洗臺(tái)面使之始終保持潔凈。
（7）凈化工作臺(tái)應(yīng)定期進(jìn)行功能測(cè)試，檢查凈化工作臺(tái)各項(xiàng)工作指標(biāo)是否達(dá)到要求，例如進(jìn)行無菌試驗(yàn)，定期檢查臺(tái)面空氣的潔凈度是否達(dá)標(biāo)。
超凈工作臺(tái)的無菌程度檢查超凈工作臺(tái)在消毒處理后，無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)；取直徑約90mm平皿，在超凈工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將平皿半開注入溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml，制成平板，在30～35℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，證明無菌后將平板3個(gè)，以無菌方式帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)左、中、右各放一個(gè)；打開平皿蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好，置30～35℃培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，100級(jí)清潔度要求：3個(gè)平皿上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均不得超過1個(gè)。
超凈工作臺(tái)應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門檢查其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級(jí)（一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）檢測(cè)塵埃粒徑≤5祄的粒數(shù)不得超過3.5個(gè)／升；空氣流量應(yīng)控制在0.75~1.0m3/s；細(xì)菌菌落數(shù)平均<1個(gè)，可根據(jù)無菌狀況必要時(shí)置換過濾器。 2．孵育區(qū)
本區(qū)對(duì)無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行，后者費(fèi)用高，一般實(shí)驗(yàn)室多采用孵箱進(jìn)行工作。
3．制備區(qū)
在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。
4．儲(chǔ)藏區(qū)
主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無塵。
5．清洗和消毒滅菌區(qū)
清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開，主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作。
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲(chǔ)藏。
1．無菌操作區(qū)
（1）無菌操作室：無菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。 理想的無菌操作室應(yīng)劃為三部分：
a) 更衣室—―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。
b) 緩沖間—―位于更衣間與操作間之間，目的是為了保證操作間的無菌環(huán)境，同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。
c) 無菌操作間—―專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過高（不超過2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑無死角以便清潔和消毒。工作臺(tái)安置不應(yīng)靠墻壁，臺(tái)面要光滑壓塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。
無菌操作間的空氣消毒：
紫外線燈—－產(chǎn)生臭氧，并且室內(nèi)溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康。 空氣過濾的恒溫恒濕裝置—－最 好。
表1 潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度級(jí)別表
潔凈度級(jí)別 塵粒最大允許數(shù)／立方米 微生物最大允許數(shù) 浮游菌／立方米 沉降菌／皿
100級(jí) 3,500 0 5 1
10000級(jí) 350,000 2,000 100 3
100000級(jí) 3,500,000 20,000 500 10
300000級(jí) 10,350,000 60,000 - 15
無臭氧紫外線消毒器
電子消毒滅菌器—－在高壓電場(chǎng)作用下，電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強(qiáng)烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，能同細(xì)菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進(jìn)行氧化分解反應(yīng)，從而靠臭氧氣體彌漫性擴(kuò)散達(dá)到殺菌之目的，消毒時(shí)沒有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30～40min即能自行還原成氧氣，空氣不留異味，消毒物體表面不留殘毒。
（2）凈化工作臺(tái)：操作簡(jiǎn)單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺(tái)主要有兩種：a)側(cè)流式或稱垂直式 b)外流式或稱水平層流式。
凈化工作臺(tái)工作原理（大致相同）—－通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。
外流式（水平式）工作臺(tái)—－凈化后的空氣面向操作者流動(dòng)，因而外方氣流不致混入操作，但進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作則對(duì)操作者不利。工作臺(tái)結(jié)構(gòu)為開放式（已少用）。
凈化工作臺(tái)應(yīng)用注意：
（1）凈化工作臺(tái)應(yīng)安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內(nèi)，以免塵土過多易使過濾器阻塞，降低凈化效果，縮短其使用壽命。
（2）新安裝的或長(zhǎng)期未使用的工作臺(tái)，工作前必須對(duì)工作臺(tái)和周圍環(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進(jìn)行滅菌處理。
（3）使用凈化工作臺(tái)前，應(yīng)先用75％酒精擦洗臺(tái)面，并提前以紫外線滅菌燈照射30～50min處理凈化工作區(qū)內(nèi)積存的微生物。關(guān)閉滅菌燈后應(yīng)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。
（4）凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流流型不受干擾。
（5）注意凈化區(qū)內(nèi)氣流的變化，一旦感到氣流變?nèi)?，如酒精燈火焰不?dòng)，加大電機(jī)電壓仍未見情況改變則說明濾器已被阻塞，應(yīng)及時(shí)更換。一般情況下，高效過濾器三年更換一次。更換高過濾器應(yīng)請(qǐng)專業(yè)人員操作，以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布（無紡布）應(yīng)定期清洗更換，時(shí)間應(yīng)根據(jù)工作環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔3-6個(gè)月進(jìn)行一次。
（6）凈化工作臺(tái)使用完畢應(yīng)及時(shí)清理工作臺(tái)面上的物品并用酒精擦洗臺(tái)面使之始終保持潔凈。
（7）凈化工作臺(tái)應(yīng)定期進(jìn)行功能測(cè)試，檢查凈化工作臺(tái)各項(xiàng)工作指標(biāo)是否達(dá)到要求，例如進(jìn)行無菌試驗(yàn)，定期檢查臺(tái)面空氣的潔凈度是否達(dá)標(biāo)。
超凈工作臺(tái)的無菌程度檢查超凈工作臺(tái)在消毒處理后，無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)；取直徑約90mm平皿，在超凈工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將平皿半開注入溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml，制成平板，在30～35℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，證明無菌后將平板3個(gè)，以無菌方式帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)左、中、右各放一個(gè)；打開平皿蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好，置30～35℃培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，100級(jí)清潔度要求：3個(gè)平皿上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均不得超過1個(gè)。
超凈工作臺(tái)應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門檢查其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級(jí)（一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）檢測(cè)塵埃粒徑≤5祄的粒數(shù)不得超過3.5個(gè)／升；空氣流量應(yīng)控制在0.75~1.0m3/s；細(xì)菌菌落數(shù)平均<1個(gè)，可根據(jù)無菌狀況必要時(shí)置換過濾器。 2．孵育區(qū)
本區(qū)對(duì)無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行，后者費(fèi)用高，一般實(shí)驗(yàn)室多采用孵箱進(jìn)行工作。
3．制備區(qū)
在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。
4．儲(chǔ)藏區(qū)
主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無塵。
5．清洗和消毒滅菌區(qū)
清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開，主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作。
